美容---皮肤养生学

第四节 靓肤化妆品功效评价方法

一、抑制非酶糖基化反应

1、实验原理：根据糖基化终产物有自发荧光的特性，采用荧光法测定荧光值，依据样品组荧光强度的大小间接计算推断样品对非酶糖基化的抑制作用。

2、实验试剂：磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，乙二醛，牛血清白蛋白，叠氮化钠(NaN₃)，氨基胍，二甲双胍，乙醇。

3、实验仪器：恒温水浴箱，荧光分光光度计。

4、试剂配制：

（1）磷酸盐缓冲液配制：A液:0.2mol/L磷酸二氢钠（M=120g/mol）溶液100mL；B液：0.2mol/L磷酸氢二钠(M=142g/mol)溶液100mL；取 A液 19mL 加入B液 81mL 配制成 pH值为 7.4 的 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)100mL备用。

（2）反应液的配制：在 100mL PBS 中加入 1.200g 乙二醛，1.000g 牛血清白蛋白和 0.200g 叠氮化钠，摇匀，形成反应液。

5、实验方法：

（1）取 1mL 反应液与 1mL 待测液混合，于 37℃ 恒温水浴箱避光孵育（A₁管）；

（2）恒温水浴箱避光孵育15天后测定荧光强度（测定条件：激发波长370nm，狭缝3nm，发射波长440nm，狭缝3nm）。

（3）空白对照：同体积的缓冲液代替样品（A₀管）；阳性对照：氨基胍或二甲双胍（100mmol/L）溶液 1mL 分别与 1mL 反应液混合作为阳性药物对照；每个样品重复五次。

6、数据处理

应用式（3-1）计算化合物对非酶糖基化反应的抑制作用，用抑制百分率(IR)表示：

IR= (1-A₁/A₀)*100%                    （3-1）

二、清除过量自由基

1、对超氧阴离子清除作用的测定

（1）实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型。邻苯三酚在弱碱性（Tris-HCl缓冲液，pH值为8.2）溶液中发生自氧化分解，产生稳定浓度的超氧阴离子自由基与中间物。中间物又与超氧阴离子自由基反应，得到一种带有颜色的中间产物，此物在紫外有吸收。在一定条件下，随着反应的进行，生成的带有颜色的中间产物在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度（319nm 波长）在反应开始后 9min 内随时间变化而线性增大。因此在该时间内，于 319nm 波长下测定被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物清除超氧阴离子自由基的能力。

（2）实验试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。

（3）实验仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,电子天平，分析天平。

（4）试剂配制：

① Tris 溶液：称取 6.05g Tris 用水溶解定容至500mL，得 0.1mol/L 的 Tris 溶液；

②0.05mol/L HCL 溶液：量取 4.29mL 浓盐酸（36%-38%）用水溶解定容至1000mL 水中，得 0.05mol/L HCL 溶液；

③10mmol/L HCL 溶液：将 0.05mol/L HCL 溶液用水稀释 5 倍即得10mmol/L HCL 溶液；

④Tris-HCL 缓冲液（pH8.2）：取一个 250mL 的烧杯，分别加入 50mL 的 0.1mol/L 的 Tris 溶液和 45mL 的 0.05mol/L 的 HCL 溶液，混匀，然后用 0.05mol/L 的 HCL 溶液调 pH 值为 8.2 即可；

⑤3mmol/L 邻苯三酚溶液：称取 0.0378g 邻苯三酚（焦性没食子酸）用10mmol/L HCL 溶液溶解定容至 100mL，得 3mmol/L 邻苯三酚溶液。现配现用，4h内有效。

（5）实验方法：

①量取 pH 值为 8.2 的 Tris-HCl 缓冲液 4.7mL 和 5mL 不同浓度的待测液于 10mL 试管中，置于 25℃ 水浴中保温 20min；

②保温结束后立即加入 0.3mL,3mmol/L 的邻苯三酚溶液，迅速摇匀后倒入比色皿中；

③用 10mmol/L 的 HCl 溶液为空白液，在 319nm 波长处，每间隔 1min 测吸光值一次，共反应 9min；

④以吸光值 A 对反应时间 t 作线性关系图，斜率即为 V₁ ,带入式一，计算清除率。空白对照组以 5mL 待测液溶剂代替样品。试剂配比表见表3-12，每个处理均做三个平行。

表3-12 超氧阴离子自由基清除实验试剂配比表

（6）数据处理：清除率可根据式（3-2）计算：

Y= [1-V₁/V₀]*100%                      (3-2)

式中 Y 为清除率，V₁ 和V₀ 分别表示待测样品和空白对照的吸光度随时间的变化率，依据以往实验的经验取V₀ = 0.035 。

2、对羟自由基清除作用的测定

（1）实验原理：羟自自基产生体系模型：在一定条件下，H₂O₂与二价铁离子混合后产生OH^。的Fenton反应为：H₂O₂+Fe²⁺= OH^。+OH^-+ Fe³⁺。羟基自由基是活性氧中化学性质最活泼的自由基，它几乎能与活细胞中任何生物大分子发生反应，且反应速度极快，是对机体危害最大的自由基。但在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕获OH^。，并产生有色产物2，3-二羟基苯甲酸，该有色产物在510nm处有强吸收峰。若在体系中加入具有清除OH^。功能的待测物，且待测物捕捉OH^。的作用大于水杨酸时，便能及时清除OH^。，从而使有色产物的生成量减少导致吸光度减小。所以采用固定反应时间法，在510nm处测量含待测物反应液的吸光度，并与空白液比较，便能测定待测物对OH^。的清除作用。

（2）实验试剂：H₂O₂，FeSO₄，水杨酸，去离子水。

（3）实验仪器：恒温水浴锅，离心机，分光光度计，比色皿。

（4）试剂配制：

①2mmol/L FeSO₄ 溶液：称取 0.304g 的无水 FeSO₄ 溶解定容于 1000mL 水中；

②1mmol/L H₂O₂ 溶液：取 0.11g（110μl）H₂O₂ 溶解定容于 1000mL 水中；

③6mmol/L 水杨酸溶液：称取水杨酸 0.828g 溶解定容于 1000mL 水中。

（5）实验方法：

①在10mL比色管中加入2mmol/L FeSO₄ 溶液3mL、6mmol/L 水杨酸溶液3mL、待测液1mL，摇匀；

②接着加入 1mmol/L H₂O₂ 溶液 3mL，摇匀，启动反应；

③于 37℃ 水浴保温 60min 后取出，测其吸光度。试剂配比表见表3-13，每个处理均做三个平行。

表3-13 羟基自由基清除实验试剂配比表

（6）数据处理：可根据式（3-3）计算羟自由基清除率

Y= [1－(A_X－A_X0)/A₀] *100%                     （3-3）

式中 Y 为清除率，其中 A_X 为一定浓度的待测样品吸光度，A_X0 为不加 H₂O₂ 溶液而用水代替的待测样品的自身吸光度值，A₀ 为空白对照，不加待测样品的吸光度值。

3、对DPPH自由基清除作用的测定

（1）实验原理：DPPH （1，1-disphenyl-2-picry1-hydrazy1），化学命名为1，1二苯基-2-三硝基苯肼，分子式为（C₆H₅）₂N^。-NC₆H₅（NO₂）₃，此化合物中在氮桥的一个原子上有一个未成对的价电子，而此电子的轨道运动几乎由分子结构所抵消，通常以捕获DPPH自由基作为评定抗氧化能力的指标。DPPH是一种稳定的有机自由基，在可见光区最大吸收峰为517nm，在乙醇溶液中，每个DPPH分子在溶液中可生成一个稳定的含氮自由基，具有典型紫色，当它与提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成无色产物，使溶液的典型紫色变浅。其褪色程度与配对电子数成化学计量关系。因而可用分光光度法进行定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的清除自由基的能力。若提取物能将其清除，则表明提取物具有降低羟自由基、烷自由基或氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。其能力用清除率来表示，清除率越大，则表明其清除自由基抗氧化能力越强。

（2）实验试剂：待测液，DPPH，无水乙醇。

（3）实验仪器：紫外可见分光光度计，石英比色皿，10mL试管，分析天平。

（4）试剂配制：

①DPPH 乙醇溶液的配置：称取 10mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，配制成浓度为 1×10^-4mol/L 的DPPH溶液，0-4℃下避光保存，现配现用，4h 内有效；

②待测液的配置：原则上待测液的浓度应在 10^-4mol/L 数量级，依据具体的原料用无水乙醇溶解。

（5）实验方法：

①取 40μL 的待测液与 2960μL 的 1×10^-4mol/L 的 DPPH 溶液混匀（A₁管）；

②取 40μL 的无水乙醇与 2960μL 的 1×10^-4mol/L 的 DPPH 溶液混匀（A₂管）；

③取 2960μL 的无水乙醇与 40μL 的待测液混匀（A₃管）；

④反应 30min 后，在 517nm 下测 A₁、 A₂、 A₃ 管吸光度值。

（6）数据处理：DPPH自由基清除率可根据式（3-4）来计算

Y=[(A₂+A₃)-A₁]/A₂*100%         （3-4）

式中 Y 为清除率，其中 A₁为一定浓度的待测样品与DPPH溶液反应后的吸光度，A₂为不加待测液而用无水乙醇代替待测样品的反应体系自身吸光度值，A₃为待测样品在反应体系中自身的吸光度值。

三、人体靓肤功效评价——分光反射率法测定皮肤色度LAB值

1、测试仪器：分光测色仪，型号CM-2600d，日本柯尼卡美能达Konica Minolta

2、测试原理：基于照明、受光光学系统设计，通过测量特定波长的光线照射在人体皮肤后的反射量来确定皮肤的色度。仪器探头的发射器发出波长为360nm-740nm的光线，照射在皮肤表面后反射，接受器接收并检测皮肤反射的光。通过接收光的波长范围和强度可以测出皮肤的LAB值，测出皮肤的色度。

3、测试范围：用于皮肤色泽的测试，本方法的适用产品类型：美白靓肤类膏霜、护肤水、乳液和啫喱等。

4、试验条件和志愿者

（1）志愿者人数：有效志愿者至少30人。

（2）志愿者条件：年龄在18～65岁之间。无严重系统疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病者。无活动性过敏性疾病者。既往对护肤类化妆品无过敏史者。近一月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂者。未参加其它临床试验者。志愿参加并能按试验要求完成规定内容者。

（3）志愿者排除条件：妊娠或哺乳期妇女；试验期间全身应用激素类、免疫制剂类药物者； 未按规定使用受试物或资料不全者。

（4）测试前所有志愿者应填写知情同意书。

5、人体测试

（1）测前准备：受测部位应洁净、近期未污染。在所需环境中静坐30min，不喝水，暴露受测部位。标记受测部位，区域间隔1cm，测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。涂抹后分别测量1周、2周、3周、4周、受试区域和空白对照区域皮肤的LAB值，每周按此时间测定。同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成。

（2）仪器操作

①接通电源，打开仪器电源开关,预热15分钟；

②在电脑桌面上打开PCQC计算机色彩品质控制系统软件；

③将分光测色仪的镜头盖（保护镜头）拿下来；

④进行白板校正：在菜单中选择“仪器控制”，再选择“白板校正”，在确认白板放好的情况下，在弹出窗框选择“开始”，进行白板校正，校正完成后，选择“退出”并离开此窗框，此时“仪器状态显示”窗框弹出，显示测色计时状况，点击“确认”即可。

⑤色度测量：在菜单中选择“文件”，再“选择指定试样文件名”，在弹出窗口中，输入新的或旧的文件名，点击“打开”，在菜单中选择“色度”，再选择“色度指标 F8”，在弹出窗框右下角点击“测量”，在新弹出的窗框里的“编号”一栏，输入此次测量的编号，将仪器镜头水平放置于被测区域，并完全覆盖，确定测量时不会漏光，轻按仪器测量按钮，1.5s后，电脑自动生成数据，点击窗框中的“存贮”按钮，将仪器放回原位，重新编号，继续下一区域的测量。

6、数据处理

（1）数据导出：指定文件，在菜单中选择“文件”，再选择“指定试样文件名”，在弹出窗口中，输入新的或旧的文件名，点击“打开”。在菜单中选择“文件”，再选择“导出”中的“色度”，点击在“光谱数据和色度数据的导出”窗框中的“请选择要导出的样品”，选择所要导出的数据。数据选择完毕后，选择色度指标（如L*A*B*），在“测试状态”中选中“测试日期”，点击“导出”，点击“确定”后退出此文件的数据导出。

（2）结果计算：对皮肤色度的测量结果进行统计学分析比较，采用t检验方法进行显著性分析检验，其中p<0.05表示有显著性差异。估计均数的抽样误差可计算该组数据的标准差或标准误。当个别数据偏差较大时，可根据t检验剔除标准进行筛选，如符合标准则可剔除；当剔除后的受试者人数少于30人时，应增加受试者人数直至符合要求。

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